印迹完成后，最后一步是图像采集和分析。 使用正确的成像系统并坚持正确的数据分析可以产生可靠、高质量的印迹数据。 成像系统的选择将取决于正在进行的研究，特别是灵敏度和帧速率要求。
不同的应用需要不同的成像系统
目前的数字成像系统主要分为两类：基于CCD的成像系统和扫描系统。 在这两种类型的系统中，最重要的特征之一是颜料的灵活性。 并非每种荧光颜料都适合每种成像系统，因此，验证系统对于您研究中使用的颜料是否具有足够的颜料灵活性非常重要。 对于多次检查，需要具有多个突发光源和多个测量滤波器的系统至关重要。 据悉，还需要确保选择最好的光源。 例如，红外颜料一般采用激光爆破，硬度高，单色性好，更容易达到颜料的吸收峰。
在这里，我们讨论成像系统评估的关键特征。
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CCD成像系统
CCD成像系统使用CCD单反进行信号测量。 将印迹（或凝胶或其他样品）放置在仪器室外，传感器捕获发出的光并生成数字化图像。 在这种类型的成像系统中，样品照明和测量的均匀性至关重要，因为整个样品是同时成像的。 因此，考虑 CCD 平台中的成像视场 (FOV) 非常重要。 视场越大，照明均匀性控制就越困难。
使用 CCD 成像时物理发光最有效。 CCD 可同时有效地对整个光谱进行采样，支持灵敏度测量所需的长时间成像（从几秒到几分钟）。 与胶片曝光一样，CCD 成像允许用户控制曝光时间。
CCD成像系统性能评估的重要激励因素
高码率、高灵敏度——CCD数字成像的一个重要特点就是像素。 像素的优点（更高的灵敏度和更高的帧速率）是将相邻像素合并为更大的像素或“超像素”的结果（图 2.4）。 较大的像素尺寸会减少可用于光子检查的区域，从而降低灵敏度。 例如，2x2 将四个相邻像素合并为一个大像素，从而将光敏感度提高 4 倍带红外光源ccd，同时保持与单个像素相同的噪点。 事实上，减小像素尺寸可以大大增强探测器的灵敏度，并且像素越大，帧速率就会提高。 1x1 使用原始像素大小（无像素），因此使用 CCD 的最高比特率。
重要的是，帧率越高，最终图像帧率就会显着降低，低码率图像可能不适合发布。 配准是一种捕获后图像处理方法，可用于恢复丢失的帧率，并且插值图像不能用于量化，因为像素（数据）是人为添加到图像中的，只能量化原始数据。
大焦距用于物理发光测量 - 特别是在物理发光测量中，F 数是需要考虑的重要值。 F值越小，焦距越大，能吸收的光线越多。 F值小的成像系统可以为CCD提供更多的光线并减少曝光时间。
多光源 - 虽然物理发光不需要光源，但荧光成像需要特定的光源和发射滤光片。
荧光成像主要使用两种光源：LED光源和激光光源。 历史上，LED 因其波长灵活性和低成本而被广泛使用。 激光技术发展迅速，现在以具有竞争力的价格提供类似的波长灵活性。 激光器单色性好，光谱窄，漏光少。 在多次检测中，可以减少交叉，更容易达到颜料的吸收峰，并且帧率可以更好。
系列成像系统↑
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扫描成像系统
扫描成像系统使用激光来爆裂样品带红外光源ccd，并使用光电倍增管 (PMT) 或雪崩光电二极管 (APD) 来测量发射的信号。 样品通常放置在成像玻璃板上，光线从顶部穿过样品。 然后可以通过 PMT 或 APD 检查发出的光。 与同时对打印样本进行成像的 CCD 成像仪不同，扫描系统在扫描时一次仅照亮样本的一小部分。 扫描实际上可能比基于 DSLR 的成像系统花费的时间稍长，但对于要求更高的研究，使用精确的点突发而不是宽视场照明可以提供所需的更高突发硬度，从而提高检查灵敏度。 据悉，使用PMT和APD可以扩大检测的动态范围，并为可见光和近红外（NIR）荧光成像提供更低的测量限和整体更好的性能。
借助 CCD 监视器也可以进行荧光印迹成像，但在扫描系统中可以获得更好的性能。 由于荧光成像不具有辣根二溴化物缀合抗原的酶信号放大功能，因此用CCD监测荧光成像往往不如物理发光那么灵敏。 然而，激光扫描仪的荧光成像可以匹配或超过物理发光的灵敏度，因为PMT和APD具有内部增益，可以像酶放大一样放大发射信号。
扫描成像系统评估关键技术
比特率 - 扫描比特率对于应用程序的灵活性非常重要。 扫描系统可以调整空间码率，允许用户选择适合特定实验的帧率。 大多数印迹膜仅需要 100-200μm 的帧速率，但某些成像应用需要更高的帧速率来捕获细节。 例如，染色组织切片成像 (IHC) 需要 10 μm 帧速率才能可视化组织细节。
扫描速率 - 与同时检查整个视野的 CCD 成像仪不同，扫描系统逐行、逐点扫描图像。 扫描区域越大，扫描时间越长。 这就是为什么选择具有快速扫描速率（通常以 cm/s 为单位）的成像系统非常重要。 扫描速度越快，成像时间越短。
突发光源 - 用于测量荧光的扫描设备，通常使用激光突发。 激光是一种准直光源，这意味着它形成一列光，几乎所有光子都以相同的方向/角度传播，并且几乎所有从光源发出的光子都有效地到达目的地。
相比之下，LED 光是散射光，其中光向多个方向散射/扩散。 当发射荧光复合物时，转移到荧光团的能量越多，发射信号就越大。 由于激光是准直光源，不会像 LED 那样发散，因此与 LED 突发相比，激光向荧光团传递突发能量的效率要高得多，从而产生更亮的发射和更低的检测限。 这些技术差异对于实现高质量至关重要。
另一个要考虑的因素是光源的数量。 激光越多，爆裂颜料的柔韧性越好。 众所周知，更多的激光器可以检查同一样品中的更多荧光复合物，例如，具有四个奇异激光器的系统可以测量单个样品中的四个荧光官能团，从而提高多次检查的效率。 容量、应用灵活性和吞吐量。
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CCD/扫描双模式成像系统
CCD/扫描双模式是新一代成像系统，可用于多种实验测量和样品类型。 如上所述，CCD 系统非常适合叶面发光和凝胶成像，因为它们允许用户控制曝光时间——凝胶成像的曝光时间短，高灵敏度化学发光成像的曝光时间长。 而且，CCD监视器没有内部增益放大机制，因此不适合高灵敏度荧光成像。
双模多光谱激光成像系统↑
此外，使用PMT和APD的激光扫描仪可以放大荧光信号并提供高灵敏度的荧光成像系统。 然而，激光扫描仪无法进行长时间曝光以进行高灵敏度物理发光测量，因此激光扫描仪并不是物理发光成像的理想选择。 将用于凝胶和物理成像的 CCD 监视器的优点与用于高灵敏度荧光 PMT 和 APD 检测器的激光扫描系统的高性能相结合，提供了两全其美的效果。 CCD/扫描双模式系统可以在多种成像模式、多种样品类型成像下实现高性能，并且具有很高的应用灵活性——这是一个理想的成像系统，包括物理发光和荧光成像。
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